吉尼斯世界纪录诞生记：显微镜最高分辨率是如何实现的？-凯发k8一触即发

撰文 | 陈震 （美国康奈尔大学）

          姜毅 （美国阿贡国家实验室）

责编 | 李娟

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图像的分辨率直接决定了我们认识世界的深度。例如，近视眼就无法看到较远的事物的很多细节。而在人类认识微观世界的过程中，显微镜的分辨率的提高往往会革新我们对世界的看法。但是，在材料研究中广泛使用的电子显微镜（以下简称电镜），距离理想成像仍然相去甚远，最好的也要差四十倍。在解蛋白质等生物大分子中广泛使用的冷冻电镜方面，由于生物分子很容易被电子束破坏，分辨率甚至相差更远。因此，进一步提高电镜的分辨率一直是科学家们努力的目标。

电镜是如何成像的

大家都知道，光学显微镜通过光学透镜聚焦可见光对样品成像。而由于可见光波长较长，分辨率只能达到几百纳米。用电子做显微镜来成像是基于量子力学的波粒二象性，也就是说，可以把通常认为是粒子的电子看成一种波，这样电子就可以类比可见光用来成像。1933年，ernest ruska发明了第一台电镜，并因此获得了1986年诺贝尔物理学奖。

电镜有很多种，常被用来研究原子结构图像的是透射电镜。我们的最新研究就是使用的透射电镜。这种电镜一般使用很高能量的电子，电子速度可达光速的一半。其成像原理是，当电子在经过材料时，由于散射效应，电子的路径和分布会被改变，探测穿透材料的电子分布，就能够得到材料的微观结构图像。在经过了近九十年发展后，透射电镜已经成为一种非常先进的实验平台，集成各种电子设备和探测器，可以获取各种类型材料的微观结构和化学组成等信息。

电镜的应用局限

由于分辨率的极限取决于波长，电子的波长远小于可见光的波长，因此，电镜发明后不久，分辨率就超越了最好的光学显微镜。随后，电镜的分辨率提高很快，到上世纪七八十年代，实现了直接观测单个原子。

然而，电磁透镜对电子的聚焦并不完美，存在很大的像差（相对于原始被成像物体，成像系统得到的图像存在畸变和模糊等差异），电镜的分辨率远未达到波长决定的极限。

早在1948年，就有对电磁透镜的像差进行矫正的理论设计，但是直到1996年，由于电脑控制技术的大幅进步和电子器件稳定性的显著提高，球差矫正器才真正被制造出来。此后，球差矫正器技术发展迅速，电镜的分辨率也飞速提高，在差不多十年内，分辨率很快从0.2纳米提高到0.05纳米。

但是，自2008年分辨率达到略好于0.05纳米之后的十年，电镜的分辨率仅有非常小的提高。而进一步提高分辨率非常困难，需要设计新的复杂透镜系统，并且要求非常稳定的电磁信号和环境系统，甚至需要担心量子扰动。

诚然，0.05纳米已经远小于普通的原子—原子间距（0.1~0.2纳米），目前的分辨率已经足够解决很多材料的结构问题。不过，这种级别的分辨率并非可以在所有材料体系中实现。首先，这个分辨率必须使用很高能量的电子成像，很多材料无法承受如此高能量的电子，在得到结构信息之前就被电子束破坏。其次，这种分辨率需要很苛刻的实验条件，在大部分实验室里根本无法实现。

►显微镜分辨率的发展历史，david muller制作

提高电镜分辨率的新途径

早在1969年，hopper, w. 提出了另外一种基于衍射的成像理论。在材料中，由于干涉效应，衍射盘重叠产生的强度强弱变化包含了材料结构的相位信息，因此，可以利用某种数学方法从衍射图反解出实空间的结构。这种方法就是我们最近的研究所采用方法的起源，称为ptychography，这个英文词来源于希腊文“折叠”，因此在这里翻译为层叠衍射成像技术。

层叠衍射成像技术的最大优势在于，理想情况下，不需要使用用于成像的电磁透镜，因此也称为无透镜成像技术（现有的数学处理方法尚不够完善，仍需要较好的物理透镜的辅助）。该方法其实也提供了一种非常有效的突破成像透镜像差对分辨率限制的途径。在x射线成像领域，由于物理透镜的加工技术所限，进一步提高分辨率非常困难，而可以比较容易提高分辨率的层叠衍射成像非常有用，因此，在很多同步辐射中心都建有专门的利用层叠衍射成像的线站。但是，在电镜中，由于受到成像系统稳定性，以及二维面探测相机在读取速度和动态范围等方面的制约，这种技术在电子显微学领域没有得到广泛关注。

该技术的实验设置如下图所示，通过移动电子束扫描样品，记录从不同位置得到的衍射图，得到包含位置和动量信息的四维数据。由于这种汇聚束衍射图的中心透射斑非常强，衍射斑非常弱，强度差很容易高达上千倍，这样就要求探测相机具有非常大的动态范围和非常高的灵敏度。并且需要在原子尺度保持稳定性，因此也要求相机的读取速度足够快。同时满足这些条件的相机在技术实现上是非常困难的。

►层叠衍射成像实验示意图

成功实现电镜最高分辨率的突破

从十几年前开始，康奈尔大学的david muller教授和sol gruner教授课题组就开始合作研发用于衍射成像的二维面探测相机。

最开始进展并不顺利，第一台相机直接使用用于探测x射线的芯片，只实现了快的读取速度和高的灵敏度，非但没有实现高的动态范围，甚至无法承受高能电子束辐照，很快就被电子束破坏而无法继续工作。

为了突破这一点，新一代的电镜像素阵列相机（empad）改进了设计，于2015年正式安装于电镜中。empad具有一到一百万电子的超大的线性响应范围，噪声小于一百四十分之一个电子，具有完全的单电子灵敏度，读取速度可达1100帧每秒，使其非常适合扫描衍射成像。在开始的应用中，david muller课题组利用该相机，采用纳米束衍射技术，实现了二维材料超高精度应变测量和铁电体极化等成像。

►实现分辨率纪录的透射电镜，图片来源于美国康奈尔大学ccmr网站

由于该相机的动态响应范围高达一百万电子，为真正采用层叠衍射成像技术提高分辨率提供了可能性。然而，提高分辨率，特别是突破现有电镜最高的分辨率仍非易事。在接近百分之一纳米的尺度，非常微小的扰动就会完全破坏成像系统的分辨率。该相机仍然有提高的空间，首先，该相机一般工作时采集图像的速度在每秒500-1000帧，仍然比通常使用的点探测器（例如，环形暗场相机）慢1000倍。较慢的采集速度会带来较大的样品漂移和辐照损伤。同时，在实际实现中，层叠衍射成像算法要求尽可能准确地知道各种实验参数，不希望有明显的样品漂移和扫描噪声。另外，因为目前电镜的分辨率已经好于通常的原子—原子间距，寻找合适的样品来标定更高的分辨率也是一个问题。

因此，优化实验条件、校正实验参数、找到合适的样品以及解决算法中的各种参数设定等都花费了我们很多的时间和精力。最终，我们选择单层二硫化钼在衍射频率空间标定分辨率，选择一种小旋转角的双层二硫化钼在实空间展示分辨率。其实，在频谱空间已经展示出，该方法和实验数据已经达到了超高分辨率。但是在电子显微学领域，真正在实空间图像上分辨出近距离的原子间距才是更为信服的分辨率标定方法。而带有旋转角的双层二硫化钼投影到平面上，提供了从两层原子完全重合到出现一定的原子错位，产生了0到大约0.2纳米连续变化的投影原子间距，因此非常适合用来标定分辨率。经过大量实验尝试和数据分析，最终，我们实现了0.04纳米的新的分辨率世界纪录。

►该工作得到的最高分辨率的图像。材料为具有小的旋转角的双层二硫化钼，中间图为实验图，周围为结构模型

应用前景

该工作发表之后，引起了很大反响。《自然》杂志专门邀请该领域的开拓者之一rodenburg, j.撰写了《突破纪录的显微镜》（a record-breaking microscope）的评论。多家主流科研评论网站都发表了评论文章。例如，chemistry world发表了《以最高分辨率对二维材料拍照》（2d materials captured at highest ever resolution）的评论。science alert发表了《新的显微学方法实现了单原子成像的新纪录》（a genius microscopy method just set a record in imaging individual atoms）的评论。phys.org则转载了康奈尔大学网站上发表的《电镜探测器实现了分辨率纪录》（electron microscope detector achieves record resolution）。并且，吉尼斯纪录也收录了该结果为最新的分辨率世界纪录。

rodenburg在《自然》的评论中说道，该工作首次证实了层叠衍射成像方法可以超越最好的物理成像透镜，产生了新的分辨率世界纪录。这么高的分辨率，并且是使用低能量低剂量的电子成像，对容易被电子束破坏的“脆弱”材料的结构表征意义重大。

我们的研究工作展示了层叠衍射成像技术的可行性和潜力，真正将该方法推向实用化。相信该方法很快会被广泛应用于解决很多类型材料的微观结构问题，例如二维材料、能源材料和多孔材料等。目前还在迅速发展的三维重构算法，加上该方法具有的高的分辨率和相位衬度，也给三维全息结构重构提供了一种可行性。另外，初步的研究表明，该方法有望赶上甚至超越目前通用的冷冻电镜的单颗粒成像技术，可能对生物大分子结构的测定产生革命性的影响，有望在解决癌症等困扰生物学和医学多年的疾病上做出贡献。

从最初被提出到真正实用化，层叠衍射成像技术的发展经过了七十年，即使从上世纪九十年代出现明确的实现方案算起，也经过了将近三十年。最初发展该方法的研究者的眼光和坚持非常值得钦佩。要知道该方法需要大量的计算机计算，在上世纪九十年代，根本无法想见电子计算机可以发展到现在这种程度，更无法预见电镜和探测相机可以达到该方法的要求。

事实上，学术研究上不乏这样的事例和研究者。发明或发展一种很有用的工具或方法，有时候可能比使用现有的工具或方法解决一个实际问题更有价值。当然，发展工具或方法也可能比解决一个实际问题困难得多。因此，科研评价在看重解决实际问题的研究的同时，也应该鼓励研发新的方法和工具。 

参考文献：

1. jiang, y., chen, z., muller, d., et al. nature 559, 343-349 (2018).

2. hopper, w., acta crystallographica a 25, 495-501 (1969).

3. rodenburg, j, faulkner, h., applied physics letters 85, 4795 (2004).

4. pfeiffer, f., nature photon, 12, 9-17 (2018).

5. rodenburg, j. nature news & views, 559, 334-335 (2018).